Circular Informativa nº 21, de 25 de março de 2020 – COVID-19: Diagnóstico Laboratorial

Para: Profissionais do Sistema de Saúde      

Assunto: COVID-19: Diagnóstico Laboratorial

Fonte: Direção Regional da Saúde

Contacto na DRS: [email protected]    

1. Diagnóstico laboratorial

1. Todos os casos suspeitos de infeção pelo Novo Coronavírus (SARS-CoV- devem ser submetidos a diagnóstico laboratorial. O diagnóstico laboratorial será realizado, preferencialmente, em laboratório hospitalar da Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico do SARS-CoV-2, na rede complementar de laboratórios privados ou no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA) – laboratório de referência nacional (Anexo I);
2. As amostras biológicas (Anexo II) são enviadas ao laboratório o mais rapidamente possível, preferencialmente em ambiente refrigerado (Anexo III), logo após a colheita da amostra biológica;
3. A deteção laboratorial do SARS-CoV-2 é feita por PCR em tempo real (RT-PCR)[1]^,[2].

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[1]  WHO (2020). Laboratory Testing for 2019 novel Coronavirus in suspected human cases. WHO. Disponível em: https://www.who.int/healthtopics/coronavirus/laboratory-diagnostics-for-novel-coronavirus

[2] A possibilidade de realização do diagnóstico SARS-CoV-2 por novos métodos de diagnóstico será atualizada, nomeadamente, por testes de diagnóstico rápido que venham a ser validados e disponibilizados no mercado português.

2. Colheita de amostras biológicas

1. A colheita de amostras biológicas (Anexo IV) deve ser efetuada por profissionais devidamente habilitados para a realização da colheita, conservação e acondicionamento das amostras biológicas;
2. Os profissionais de saúde que realizem colheitas de amostras biológicas devem cumprir com rigor as recomendações de utilização de equipamento de proteção individual (Anexo V);
3. É fortemente recomendado que sejam colhidas amostras do trato respiratório inferior, sobretudo em doentes com doença mais grave; 
4. Uma única amostra do trato respiratório superior pode não excluir a infeção, sendo preferível o envio de duas amostras respiratórias de locais diferentes;
5. Para o diagnóstico de COVID-19 está indicada a colheita de amostras do trato respiratório (superior e/ou inferior, de acordo com o contexto clínico), podendo estas ser completadas, para fins de controlo ou de estudo, por colheita de soro ou de outras amostras.

2.1. Amostras respiratórias

Devem ser colhidas amostras respiratórias:

1. Trato respiratório superior
   1. Exsudado da nasofaringe e exsudado da orofaringe colhido com zaragatoa em meio de transporte para vírus. As duas amostras colhidas com zaragatoas devem ser colocadas no mesmo tubo contendo meio de transporte para vírus (2-3 ml). Deve dar-se prioridade à colheita do exsudado da nasofaringe, quando não for possível a colheita dos dois exsudados; 
   1. Expetoração (se existente).
2. Trato respiratório inferior
   1. Aspirado endotraqueal ou lavado bronco-alveolar, em doentes com doença respiratória grave.

Se analisada apenas um tipo de amostra, com resultado laboratorial negativo para COVID-19, em doentes internados e se o agravamento da doença o justificar, é recomendada a colheita de uma segunda amostra para o diagnóstico laboratorial.

Em idade pediátrica: deve colher-se uma amostra de exsudado da nasofaringe e uma amostra de exsudado da orofaringe.

1. Instruções de colheita dos exsudados[1]:
2. Exsudado da nasofaringe: Inserir a zaragatoa numa das narinas paralelamente ao palato até sentir uma ligeira resistência. Deixar a zaragatoa durante alguns segundos para absorção das secreções. Remover lentamente com movimento de rotação. Repetir a colheita na outra narina.
3. Exsudado da orofaringe: Inserir a zaragatoa na cavidade oral até à faringe posterior, evitando tocar na língua.

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[1] Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from Persons for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), CDC, 19 março, 2020.

2.2. Soro

1. Duas amostras de soro de fase aguda e de convalescença (2-4 semanas após fase aguda) para a realização de testes serológicos;
2. Os testes serológicos poderão suportar a investigação futura dos casos de infeção pelo SARS-CoV-2. Devem ser utilizados em complemento do diagnóstico por biologia molecular (RT-PCR).

2.3. Outras amostras

1. Em indivíduos assintomáticos com contacto próximo com doente com infeção COVID-19 confirmado, realizar a colheita de amostras do trato respiratório superior e uma amostra de soro, se houver indicação para tal;
2. Em doentes falecidos, considerar a análise de amostras respiratórias e material de autópsia incluindo material de tecido pulmonar, se a autópsia for considerada necessária[1];
3. Em doentes sobreviventes considerar a colheita e conservação de um par de soros (fase aguda e de convalescença) para o estudo imunitário retrospetivo.

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[1]  Consultar Circular Normativa n.º17, de 23 de março de 2020 – Infeção por SARS-CoV-2 (COVID-19) – Cuidados post mortem, autópsia e casas mortuárias (https://covid19.azores.gov.pt/?page_id=19) 

3. Comunicação com o laboratório

Para assegurar uma boa comunicação com o laboratório, o laboratório deve ser informado da proveniência das amostras biológicas. As amostras devem ser corretamente identificadas e acompanhadas da notificação do SINAVE com a informação relativa ao doente, se aplicável.

4. Condições de segurança no acondicionamento e transporte de amostras biológicas

Os profissionais de saúde devem cumprir as regras de prevenção e controlo de infeção aplicáveis bem como a correta e adequada utilização de EPI, de acordo com a Circular Normativa n.º 04, de 31/01/2020 – “Prevenção e Controlo de Infeção por novo Coronavírus (2019-nCoV) – Procedimentos a adotar para minimizar o risco de transmissão”[5] e o Anexo V da presente Circular Informativa.

De modo a acondicionar e transportar corretamente as amostras, deve proceder-se da seguinte forma:

1. Após a colheita de amostras biológicas, os tubos e recipientes devem ser bem vedados;
2. Os tubos e recipientes devem ser desinfetados exteriormente, no local da colheita, com solução de hipoclorito de sódio a 1% – 10.000ppm (1 parte de hipoclorito de sódio em 9 partes iguais de água) e de seguida, com álcool a 70%;
3. Por fim, a tampa do tubo deve ser selada com película parafilme;
4. Acondicionar as amostras biológicas, seguindo as normas de embalagem de substâncias infeciosas recomendadas pela Organização Mundial de Saúde[1] para amostras classificadas de categoria B (UN 3373);
5. Utilizar o sistema de embalagem tripla com as seguintes características:
6. Contentor primário é o que contém a amostra; deve estar devidamente identificado e tem de ser estanque a líquidos e a sólidos; tem de ser embalado em material absorvente suficiente para absorver todo o conteúdo em caso de quebra ou derrame e envolvida por plástico;
7. Contentor secundário é o que leva os contentores primários (tubos de amostras) e é resistente, à prova de água e estanque a líquidos e a sólidos; pode conter vários tubos de amostras desde que estes sejam protegidos com material absorvente e amortecedor, individualmente e separados, cada uma no seu saco de plástico bem fechado, a fim de evitar o contacto;
8. Contentor exterior é a embalagem de transporte externa com material de acolchoamento adequado, onde se colocam os contentores secundários. A menor dimensão externa global utilizada deve ser de 10 x 10 cm. 
9. O transporte das amostras deve ser realizado, preferencialmente, por uma empresa certificada e autorizada para o efeito (Categoria B, UN 3373) ou em alternativa, em transporte próprio da unidade de saúde, cumprindo as indicações de acondicionamento anteriormente referidas;

Este procedimento é da responsabilidade da unidade de saúde que realiza a colheita das amostras biológicas e deve ser acompanhado de impressão da notificação efetuada no SINAVE.

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[1] WHO (2020). Guidance on regulations for the transport of infectious substances 2019–2020. WHO. Disponível em: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/325884/WHO-WHE-CPI-2019.20-eng.pdf

IATA (2011). PACKING INSTRUCTION 650. IATA. Disponível em: https://www.iata.org/contentassets/b08040a138dc4442a4f066e6fb99fe2a/dgr-61-en-pi650.pdf   

5. Testes laboratoriais

O tratamento das amostras biológicas e a inativação do RNA viral deve ser realizada no laboratório em câmara de biossegurança de nível 2 (BSL-2).

5.1. PCR em tempo-real para o SARS-CoV-2

O diagnóstico específico do novo coronavírus é realizado pela metodologia de amplificação dos ácidos nucleicos, pela reação de polimerase em cadeia (PCR). 

Um caso confirmado laboratorialmente apresentará as duas reações de PCR positivas. As amostras duvidosas ou que necessitem de análise complementar devem ser enviadas ao Laboratório Nacional de Referência para o Vírus da Gripe e outros Vírus Respiratórios do Departamento de Doenças Infeciosas, do INSA.

Em áreas onde existe transmissão comunitária ativa de COVID-19, a deteção dos casos por um único teste discriminatório, pela metodologia de RT-PCR para um alvo, será considerada suficiente[7]. Os testes confirmatórios devem ser realizados apenas para resultados inconclusivos ou com um valor de ciclo de amplificação do RT-PCR superior a 35. Recomenda-se nestes casos a repetição do teste e/ou da colheita da amostra biológica.

5.2. Sequenciação do genoma viral^6,[8]

A metodologia de sequenciação de nova geração (NGS) está disponível no INSA, para a realização do estudo do genoma do SARS-CoV-2. 

Para além da confirmação de casos de infeção pelo SARS-CoV-2, a integração da análise genómica do novo coronavírus com a informação epidemiológica e clínica dos casos de COVID-19 é crítica para o estudo e controlo da transmissão do vírus na comunidade, monitorização da doença e de marcadores genómicos associados à gravidade da doença.

O conhecimento do genoma viral permite ainda avaliar o desempenho dos testes de diagnóstico laboratorial. 

É fortemente recomendada a partilha das sequências virais em bases de dados, como o GISAID, que garantem os direitos de autor e de submissão.

Devem ser enviadas ao Laboratório Nacional de Referência para o Vírus da Gripe e outros Vírus Respiratórios do Departamento de Doenças Infeciosas, do INSA, para sequenciação do genoma viral todas as amostras positivas de casos de COVID-19.

A caraterização virológica deverá incluir sequências de vírus que representem diferentes momentos da epidemia, grupos etários e áreas geográficas[9].

6. Monitorização laboratorial de casos confirmados[10]

Recomenda-se o envio ao INSA de colheitas sequenciais de amostras respiratórias e de outras origens para o estudo da duração da excreção do vírus.

O RNA viral pode permanecer detetável em fluídos corporais do doente por longo período de tempo, não significando que o vírus se encontre no seu estado infecioso⁶.

Os critérios para libertação do isolamento consensualizados pelo ECDC⁶ implicam:

O critério para a declaração da completa eliminação do vírus e resolução da doença COVID-19 implica:

Devido à crescente evidência de excreção do vírus através das fezes de doentes em fase de convalescença, particularmente nas crianças, recomenda-se um reforço da higiene pessoal após libertação do isolamento.

Onde posso obter mais informação?

Mais informação pode ser encontrada em http://covid19.azores.gov.pt.

Referências bibliográficas

CDC. Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from Persons for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). CDC. 19 march, 2020. Disponível em: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/guidelines-clinical-specimens.html.  

DGS. Norma nº 002/2020 de 16/03/2020 atualizada a 19/03/2020, disponível em https://www.dgs.pt/directrizes-da-dgs/normas-e-circulares-normativas/norma-n-0022020-de16032020.aspx.  

DGS. Plano Nacional de Preparação e Resposta à Doença por novo coronavírus (COVID-19), DGS, 2020. Disponível em: https://www.dgs.pt/documentos-e-publicacoes/plano-nacional-depreparacao-e-resposta-para-a-doenca-por-novo-coronavirus-covid-19-pdf.aspx.  

ECDC. Novel coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic: increased transmission in the EU/EEA and the UK – sixth update 12 March 2020. Disponível em: https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/RRA-sixth-update-Outbreak-of-novelcoronavirus-disease-2019-COVID-19.pdf.

ECDC. Novel coronavirus (SARS-CoV-2) Discharge criteria for confirmed COVID-19 cases – When is it safe to discharge COVID-19 cases from the hospital or end home isolation? ECDC Technical Report, 10 março, 2020.

IATA (2011). PACKING INSTRUCTION 650. IATA. Disponível em: http://www.iata.org/whatwedo/cargo/dgr/Documents/DGR52_PI650_EN.pdf. 

WHO (2020). Laboratory Testing for 2019 novel Coronavirus in suspected human cases. WHO. Disponível em: https://www.who.int/healthtopics/coronavirus/laboratory-diagnostics-for-novelcoronavirus.  

Anexo I – Laboratórios com capacidade para diagnóstico laboratorial (sujeito a atualização contínua)

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[1]  WHO (2020). Laboratory Testing for 2019 novel Coronavirus in suspected human cases. WHO. Disponível em: https://www.who.int/healthtopics/coronavirus/laboratory-diagnostics-for-novel-coronavirus

[2] A possibilidade de realização do diagnóstico SARS-CoV-2 por novos métodos de diagnóstico será atualizada, nomeadamente, por testes de diagnóstico rápido que venham a ser validados e disponibilizados no mercado português.

[3] Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from Persons for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), CDC, 19 março, 2020.

[4]  Consultar Circular Normativa n.º17, de 23 de março de 2020 – Infeção por SARS-CoV-2 (COVID-19) – Cuidados post mortem, autópsia e casas mortuárias (https://covid19.azores.gov.pt/?page_id=19) 

[5] https://covid19.azores.gov.pt/?page_id=587

[6] WHO (2020). Guidance on regulations for the transport of infectious substances 2019–2020. WHO. Disponível em: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/325884/WHO-WHE-CPI-2019.20-eng.pdf

IATA (2011). PACKING INSTRUCTION 650. IATA. Disponível em: https://www.iata.org/contentassets/b08040a138dc4442a4f066e6fb99fe2a/dgr-61-en-pi650.pdf   

[7] ECDC. Novel coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic: increased transmission in the EU/EEA and the UK – sixth update, ECDC, 12 março, 2020. Disponível em: https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/RRA-sixthupdate-Outbreak-of-novel-coronavirus-disease-2019-COVID-19.pdf

[8] Plano Nacional de Preparação e Resposta à Doença por novo coronavírus (COVID-19), DGS, 2020. Disponível em: https://www.dgs.pt/documentos-e-publicacoes/plano-nacional-de-preparacao-e-resposta-para-a-doenca-por-novocoronavirus-covid-19-pdf.aspx

[9]  Plano Nacional de Preparação e Resposta à Doença por novo coronavírus (COVID-19), DGS, 2020. Disponível em: https://www.dgs.pt/documentos-e-publicacoes/plano-nacional-de-preparacao-e-resposta-para-a-doenca-por-novocoronavirus-covid-19-pdf.aspx

[10] ECDC. Novel coronavirus (SARS-CoV-2) Discharge criteria for confirmed COVID-19 cases – When is it safe to discharge COVID-19 cases from the hospital or end home isolation? ECDC Technical Report, 10 março, 2020

Anexo I – Laboratórios com capacidade para diagnóstico laboratorial (sujeito a atualização contínua)

Anexo II – Colheita de amostras biológicas

Anexo III – Transporte e acondicionamento de amostras biológicas

Anexo IV – Diagnóstico laboratorial do novo coronavírus em casos suspeitos sob investigação

Anexo V – Equipamento de Proteção Individual (EPI) de acordo com o nível de cuidados a prestar

*Para uma otimização dos respiradores:

• O profissional que faz as colheitas, pode permanecer com o mesmo respirador desde que seja escalado apenas para esta função, ou seja, num turno faz apenas colheitas de amostras respiratórias;
• O respirador tem uma durabilidade que pode ir de 4-6 horas;
• Caso o respirador fique húmido, deve ser substituído.

Anexo: Circular informativa n.º 21